Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения очищенного рекомбинантного GDF-5-подобного белка. Способ включает разрушение клеток E.coli с помощью гомогенизатора высокого давления при давлении разрушения от 800 до 900 бар. Выделяют тельца включения из разрушенных клеток E.coli центрифугированием. Обрабатывают выделенные тельца включения денатурирующим буфером для солюбилизации, содержащим мочевину и L-аргинин. Очищают солюбилизированный мономер рекомбинантного GDF-5-подобного белка центрифугированием и хроматографией. Предложенное изобретение позволяет получить очищенный рекомбинантный GDF-5-подобный белок с высоким выходом. 6 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл., 5 пр.

Рисунки к патенту РФ 2491290

Это изобретение относится к усовершенствованному способу эффективного продуцирования в прокариотах и очистки рекомбинантных белков фактора роста. Более конкретно, изобретение касается модификаций способа, приводящих к более высокому выходу белка, к большей чистоте продукта и к улучшенной промышленной применимости упомянутого способа.

Факторы Роста и Дифференциации (GDF) являются гомодимерными цитокинами, промотирующими клеточную пролиферацию/дифференциацию и регенерацию тканей. Среди всех факторов роста/дифференциации наиболее полезным в широком диапазоне медицинских применений является Фактор Роста/Дифференциации 5 (GDF-5). Ранее наиболее успешно применялись остеогенные свойства GDF-5, например, при оказании помощи при лечении локальных переломов кости. GDF-6 и GDF-7 являются наиболее родственными к GDF-5 белками, с похожими биологическими функциями и чрезвычайно высокой аминокислотной гомологией. Группа GDF-5/-6/-7 консервативна среди млекопитающих, но не имеет ортологов у беспозвоночных (Ducy and Karsenty 2000, Kidney Int. 57, 2207-2214).

In vivo, представители этого белкового семейства изначально синтезируются в виде больших белков-предшественников, которые последовательно подвергаются протеолитической деградации в состоящем из основных аминокислотных остатков кластере, находящемся на расстоянии в 110-140 аминокислотных остатков от С-конца белка; таким образом, от N-концевого продомена отделяются C-концевые биоактивные зрелые белковые фрагменты. Все зрелые полипептиды структурно похожи и содержат консервативные биоактивные домены, содержащие шесть или семь канонических цистеинов. Дисульфидные мостики между этими аминокислотными остатками создают типичный для этого белкового семейства трехмерный мотив "цистиновый узел".

Ранее уже была достигнута экспрессия зрелого GDF-5 в прокариотических клетках-хозяевах (см., например, Biochem. Biophys. Res. Commun., 204, pp.646-652, 1994). Однако эти белки сложно получить в очищенном виде. При их экспрессии в Е. coli в больших объемах, искомый белок часто состоит из мономерного и неактивного белка с молекулярной массой равной 14 кДа, который накапливается в тельцах включения. С целью получения димерного биоактивного фактора роста (28 кДа), мономерный белок из телец включения должен быть солюбилизирован, очищен и ренатурирован с образованием гомодимера с типичной структурой цистеинового узла. Эта процедура часто называется "рефолдингом".

Из-за крайне низкой растворимости в водных растворах при значениях pH от 4 до 9, а также из-за других редких белковых свойств, в способы очистки и рефолдинга продуцируемых в прокариотах GDF-5-подобных белков необходимо включать несколько специально подобранных этапов. Например, поскольку после рефолдинга GDF-5-подобные белки, как правило, адсорбируются хроматографическим носителем, становится очевидным, что очистка искомого белка в больших объемах не может быть осуществлена в соответствии со стандартными протоколами очистки с помощью водных хроматографических компонентов. После рефолдинга белка применимыми являются первичные способы очистки на основе органических растворителей (такие как, обратнофазная хроматография).

Недавно разработанный способ получения и очистки рекомбинантных GDF-5-подобных белков раскрыт в WO 96/33215. Способ основан на очистке перед процедурой рефолдинга мономерного белка и содержит следующие существенные этапы:

1. Выращивание бактериальной культуры, разрушение клеток и высвобождение телец включения,

2. Обработка денатурирующими агентами для получения солюбилизированного мономера,

3. Разделение ионообменной хроматографией,

4. Сульфирование (этап сульфирования не является обязательным),

5. Разделение гель-фильтрацией,

6. Рефолдинг,

7. Разделение изоэлектрической преципитацией,

8. Разделение обратнофазной хроматографией.

Хотя описанный выше способ, в общем, применим, в данном случае на первых двух этапах обработки имеются некоторые трудности, влияющие как на выход, так и на чистоту целевого белка. Достижимый выход GDF-5-подобного белка значительно ниже теоретически ожидаемого, в основном, за счет случаев частичной деградации в связи с необычной мутностью/вязкостью раствора, полученного при солюбилизации белка из телец включения. Таким образом, очевидно, что указанные параметры и условия способа должны быть улучшены.

Цели этого изобретения заключаются в преодолении вышеупомянутых проблем и в оптимизации выхода и чистоты рекомбинантных GDF5-подобных белков.

Эти цели решены путем разработки раскрытых далее усовершенствованных способов для получения рекомбинантных GDF5-подобных белков в Е.coli.

Наиболее часто используемые термины должны быть определены и представлены следующим образом до подробного описания изобретения:

Используемый здесь термин «домен цистинового узла», означает хорошо известный, консервативный, богатый цистеином аминокислотный участок, присутствующий в зрелой части белков суперсемейства TGF-beta, таких как человеческий GDF-5, и формирует трехмерную белковую структуру, известную как цистиновый узел. В этом домене важным является соответствующее расположение относительно друг друга цистеиновых остатков и в нем, в целях сохранения биологической активности, позволены лишь незначительные изменения. Было продемонстрировано, что домен цистинового узла сам по себе достаточен для биологической активности белка (Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). Консенсусные последовательности для доменов цистинового узла хорошо известны в данной области. Согласно определению, определенный здесь белковый домен цистинового узла начинается с первого цистеинового остатка, участвующего в цистиновом узле соответствующего белка, и заканчивается на аминокислотном остатке, следующем после последнего цистеина, участвующего в цистиновом узле соответствующего белка. Например, домен цистинового узла белка-предшественника человеческого GDF-5 (SEQ ID NO:1) состоит из аминокислотных остатков 400-501 (см. также фиг.1).

Использованный здесь термин "GDF-5-подобный белок" означает любой естественно или искусственно полученный белок, который содержит домен цистинового узла, гомологичный по аминокислотным остаткам, по меньшей мере, 60% из 102 АК домена цистинового узла человеческого GDF-5 (аминокислоты 400-501 последовательности SEQ ID NO:1). Этот термин включает в себя белки с аналогичными биофизическими свойствами, принадлежащие к группе белков GDF-5, GDF-6 и GDF-7 позвоночных или млекопитающих, а также их рекомбинантные варианты, поскольку последние демонстрируют упомянутый выше процент гомологии с доменом цистинового узла человеческого GDF-5. Равное 60-ти % предельное значение хорошо подходит для отделения представителей группы белков GDF-5/-6/-7, а также их вариантов от других белков таких, как другие GDF и BMP белки. Сравнение состоящих из 102 АК доменов цистинового узла человеческого GDF-5 и человеческого GDF-7 (см. фиг.2) выявило высокую степень аминокислотной гомологии между этими белками. Человеческий GDF-6 совпадает в 87 аминокислотных остатках (85%), а человеческий GDF-7 - в 83 (81%) аминокислотных остатках с доменом цистинового узла человеческого GDF-5. Соответствующие домены молекул GDF-5/-6/-7 из других позвоночных и млекопитающих, определенных на данный момент, также показывают высокий процент гомологии, составляющий, по меньшей мере, 75% (от 79% до 99%) при сравнении с человеческим GDF-5. В отличие от них, GDF и BMP, не принадлежащие к подгруппе GDF-5/-6/-7, демонстрируют гораздо меньшую степень гомологии, ниже 60% (см. фиг.3).

Определение соответствующих позиций аминокислот в соответствующих аминокислотных последовательностях, а также расчет процента гомологии между ними может легко осуществлено с помощью хорошо известных алгоритмов выравнивания, а также с помощью использующих эти алгоритмы компьютерных программ. Например, аминокислотная гомология в этой заявке на патент (например, фиг.2) была рассчитана на выровненных последовательностях с помощью свободно-распространяемой программы ClustalX (Версия 1.81) с оставленными по умолчанию настройками, и с последующим подсчетом идентичных остатков вручную. Настройками по умолчанию для попарного (медленно-точного) выравнивания являются: штраф за открытие делеции: 10; штраф за продолжение делеции: 0,10; матрица сравнения аминокислот: Gonnet 250. Программа ClustalX детально описана в работе Thompson.J.D., Gibson.T.J., Plewniak.F., Jeanmougin.F. and Higgins.D.G. (1997):

The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools.

Nucleic Acids Research 24:4876-4882.

ClustalX является портированной в ОС Windows программой множественного выравнивания последовательностей ClustalW, т.е. доступна из различных источников, например, доступна по анонимным FTP-адресам ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.emblheidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk или доступна путем загрузки со следующей вэб-страницы: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/. Программа ClustalW и алгоритм также детально описаны в работе Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, T.J. (1994):

CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice.

Nucleic Acids Research 22:4673-4680.

Используемый здесь термин "вариант", относится к следующим полипетидам:

а) к биологически активным фрагментам белка,

б) к биологически активным белковым конструкциям, содержащим дополнительные последовательности сверх исходной последовательности белка,

в) к любой комбинации а) и б).

Термины "буфер для растворения" или "буфер для солюбилизации" телец включения означают растворы, которые используют для солюбилизации телец включения и денатурации белков из упомянутых телец включения.

Термин "биологическая активность" обозначает активность терапевтических соединений, включающих, например, GDF-5-подобный белок, измеренную обычным in vitro анализом щелочной фосфатазы, например, как описано в примере 5 или в работе Takuwa et al. (1989), Am. J. Physiol. 257, E797-E803. Клеточные линии ATDC-5 или MCHT 1/26 подходят для использования в таком анализе щелочной фосфатазы.

Подробное описание изобретения

Способ производства рекомбинантных GDF-5-подобных белков и особенно человеческого рекомбинантного GDF-5 состоит из следующих начальных этапов: этапа культивирования Е. coli; этапа сбора биомассы; этапа разрушения клеток; этапа сбора/отмывки телец включения и этапа растворения телец включения в денатурирующих условиях. Далее денатурированный белок на последующих этапах подвергается очистке и рефолдингу как, например, описано в WO 96/33215.

Упомянутый этап разрушения клеток обычно производится с помощью гомогенизатора высокого давления. После этого, обычно, тельца включения (ТВ) собираются центрифугированием и (опционально) несколько раз промываются. Тщательное растворение (солюбилизация) белка из телец включения перед последующими этапами очистки достигается за счет образования суспензии в буфере для солюбилизации, содержащем высокие количества денатурированной мочевины.

Примечательно, что раствор для солюбилизации, содержащий мономерный и денатурированный белок из телец включения, является крайне мутным и вязким, даже после предварительных этапов фильтрации или центрифугирования. В то же время, происходит время-зависимая фрагментация мономерного GDF-5 (см. фиг.5), процесс, который, в конечном счете, приводит к разрушению/изменению массы значительной доли мономеров GDF-5. Менее чем за 1,5 часа масса зрелого мономерного белка в растворе для растворения значительно уменьшается от первоначальных 14 кДа, до, примерно, 10 кДа. Эта нежелательная и быстрая деградация, по-видимому, является зависимой от аминокислотной последовательности/конформации белка и происходит исключительно на этапе солюбилизации телец включения. Процесс время-зависимой деградации особенно мешает производству белка в больших/промышленных масштабах т.к. производственные периоды из-за повышенных объемов обычно увеличены, что, как следствие, приводит к значительному сокращению выхода и чистоты GDF-5-подобного белка, полученного в конце всей процедуры очистки.

В целях преодоления описанных проблем изобретатели провели многочисленные исследования с помощью различных подходов, приведших, в конце концов, к модификации способа очистки. Эти опыты включали: вариации процедуры разрушения клеток; эксперименты по инактивации протеаз в целях борьбы с потенциальным энизматическим/протеолитическим загрязнением; коррекцию концентраций критических компонентов буферов для солюбилизации и/или отмывки; и добавление различных химических соединений в буфер для солюбилизации.

Принимая во внимание тот факт, что различные подходы для проверки и инактивации предполагаемой, способствующей наблюдаемой деградации белков, протеолитической активности потерпели неудачу (см. пример 3: Химическое ингибирование и термическая инактивация), изобретатели обнаружили, что уменьшение фрагментации белков и более высокие выход/чистота белка могут, тем не менее, быть достигнуты путем введения либо по отдельности, либо (что предпочтительней) вместе, двух важных, связанных со способом, модификаций. Эти модификации являются конкретными воплощениями раскрытого изобретения и относятся к 1) адаптации процедуры разрушения клеток и к 2) оптимизации состава буфера для солюбилизации.

1) Модификация разрушения клеток гомогенизацией при высоком давлении

Было обнаружено, что необычно высокие мутность и вязкость раствора для солюбилизации (содержащего солюбилизированные тельца включения) являются пагубными для последующих этапов очистки GDF-5-подобных белков и их следует избегать. Принимая во внимание то, что ни фильтрация, ни дополнительные этапы центрифугирования перед солюбилизацией телец включения, не могут решить эту проблему, неожиданно было обнаружено, что ее решение может быть найдено путем крайне избирательной модификации прилагаемого для разрушения клеток давления. Принимая во внимание то, что давление обычно изменяется в широком диапазоне (например, от 100 до 2000 бар) без драматических последствий для солюбилизации телец включения, крайне важно ограничить это давление в узком диапазоне при очистке GDF-5-подобных белков. Точнее, если для разрушения применяется давление между 800-900 бар, то получается значительно более прозрачный раствор солюбилизированных телец включения и увеличивается выход продукта после первой части способа очистки GDF-5-подобных белков. Кроме того, соотношение рекомбинантный GDF-5 к общему белку существенно улучшилось при высоком давлении для разрушения. Из-за лучшей фильтруемости общее время обработки становится меньше и, следовательно, время-зависимая фрагментация уменьшается. Давления разрушения выше и ниже этого диапазона являются пагубными и ведут к значительному уменьшению выхода белка (см., например, фиг.6).

2) Модификации композиции буфера для солюбилизации

Следующие модификации компонентов буфера для солюбилизации покрываются этим изобретением:

Мочевина/добавка с L-аргинином.

Хотя пагубный эффект мочевины на стабильность первичной структуры факторов роста и дифференциации ранее не был описан для данного уровня техники, изобретателями было обнаружено, что фрагментация GDF-5-подобных белков не происходит, если мочевина полностью удаляется из всех контактирующих с тельцами включения растворов (например, из буферов для отмывки и солюбилизации). Однако, удаление денатурирующего агента из буфера для солюбилизации невозможно из-за необходимости поддержания требуемого эффекта денатурации. К сожалению, замена мочевины на гуанидин гидрохлорид в качестве альтернативного денатурирующего агента не рекомендуется при использовании в оборудовании промышленного производства из-за коррозийных свойств солей гуанидина (которые в некоторых случаях могут приводить к уменьшению экономически целесообразного ресурса труб и танков). Кроме того, гуанидин гидрохлорид очень дорог и может повысить связанные со способом затраты.

Поэтому изобретатели искали альтернативный способ для устранения вышеупомянутого, связанного с протеазами, распада GDF-5. В результате тщательных экспериментов было обнаружено, что упомянутую фрагментацию GDF-5-подобных белков можно устранить в буферах для солюбилизации, содержащих мочевину, если упомянутые растворы в качестве защитной добавки дополнить L-аргинином в определенной концентрации.

В примере 3/фиг.7 и 8 продемонстрировано, что добавление L-аргинина в содержащие мочевину растворы уменьшает или устраняет деградацию GDF-5 в зависимости от концентрации. Деградация может быть уменьшена примерно на 50 процентов с буферами, содержащими, по меньшей мере, 100 мМ L-аргинина, и может быть полностью остановлена при использовании буферов для растворения, содержащих 500 мМ (или более) L-аргинина. Даже незначительные концентрации L-аргинина (например, 1 мМ L-аргинин в буфере А4 из примера 3) демонстрируют детектируемый, ингибирующий фрагментацию, эффект.

Использование L-аргинина имеет несколько преимуществ при использовании в качестве дополнительного ингредиента мочевина-содержащих буферов для солюбилизации телец включения с GDF-5-подобными белками. Во-первых, L-аргинин является сравнительно недорогим химикатом и экономическая эффективность способа очистки белка сохраняется, несмотря на добавление этого вещества. Во-вторых, комбинация мочевины и L-аргинина значительно менее коррозионна, чем денатурирующий раствор с гуанидин гидрохлоридом. В-третьих, L-аргинин является более экологически чистым химическим соединением по сравнению с солями гуанидина, которые требуют специальной утилизации. Это преимущество делает изобретение особенно полезным для промышленных установок с состоящими из металла устройствами. К тому же L-аргинин может легко быть удален в процессе очистки с помощью простого этапа диафильтрации, например, непосредственно после солюбилизации телец включения. Это особенно важно, поскольку предлагаемое добавление L-аргинина к буферу для солюбилизации мешает последующему связыванию GDF-5-подобных белков на ионобменной хроматографической колонке (см. пример 4). Проведение диафильтрации и ионообменной хроматографии упрощается, если после солюбилизации телец включения в целях удаления высокомолекулярных примесей, таких как клеточный дебрис, применяются (по необходимости) дополнительные этапы очистки (например, центрифугирование, объемная фильтрация и/или стерилизующая фильтрация). Возможные параметры размеров пор для объемной фильтрации составляют 0,1-0,7 мкм, для стерилизующей фильтрации, например, 0,22 мкм.

Таким образом, в соответствии с предпочтительным воплощением изобретения и в целях предотвращения белковой фрагментации/деградации, буфер для солюбилизации телец включения с GDF-5-подобными белками должен содержать L-аргинин. Предпочтительная концентрация этой добавки находится в диапазоне от 100 до 1000 мМ L-аргинина в буферах для солюбилизации по изобретению. Наиболее предпочтительная концентрация равна 400-500 мМ L-аргинина. Однако также возможно использование более высоких концентраций L-аргинина (например, до 2000 мМ), которые могут быть полезны в случае чрезвычайно длительных периодов инкубации/обработки.

Буферам для солюбилизации по изобретению свойственно содержание мочевины в качестве денатурирующего агента в концентрации от 2 до 10 М. Предпочтительно, если концентрация мочевины находится в диапазоне от 4 М до 8 М. Наиболее предпочтительным является буфер для солюбилизации содержащий 6 М мочевину.

Другие части изобретения связаны с дальнейшими модификациями упомянутых буферов для солюбилизации, имеющих менее сильное, но, тем не менее, значительное влияние на производительность способа.

В соответствии со способом очистки рекомбинантного GDF-5, раскрытого в WO 1996/033215, значение pH, равное 8,3, описывается в качестве пригодного для буферов для солюбилизации GDF-5-подобных белков. Однако в настоящее время обнаружено (см. также пример 3 /фиг.7), что использование буферов для солюбилизации с более высокими значениями pH в диапазоне от 9,0 до 11,0 уменьшает деградацию и увеличивает количество общего белка полученного в процессе очистки. Этот факт может быть объяснен с помощью профиля pH-зависимой растворимости GDF-5, который показан на фиг.9. Его растворимость низка при pH 8,3, но значительно увеличивается при более высоких значениях pH. Таким образом, pH в диапазоне между 9.0 и 11,0 также полезна для буферов для солюбилизации по изобретению.

Хелаторы:

Также может быть модифицирована концентрация хелаторов в буферах для солюбилизации. Хелаторы используются для безопасного связывания металлов, таких как ртуть, мышьяк и свинец. Наиболее часто используемым синтетическим хелатором является EDTA, который используется в буферах солюбилизации по изобретению (например, в форме Na 2 EDTA или Na 3 EDTA). По данным экспериментов, описанных в примере 3, выгодно увеличивать концентрацию хелаторов от изначально описанной 1 ммоль/литр (см. WO/1996/033215) до 5-100 ммоль/л, предпочтительно до 5-50 ммоль/л.

Наиболее предпочтительные буферы для солюбилизации содержат следующие компоненты: 20 мМ Tris-HCl

6 М мочевина

500 мМ L-аргинин

5 мМ Na 3 EDTA

Основные модификации способа по изобретению показаны на фиг.10. Следует отметить, в виде меры предосторожности, что предлагаемая схема очистки представляет собой предпочтительное воплощение изобретения, но при этом изобретение ни в коей мере не ограничивается этим порядком или количеством этапов обработки (особенно в отношении этапов с 5 по 9 на фиг.10). Одиночные этапы могут быть опущены, заменены или дополнены другими способами очистки, при условии, если вся процедура очистки содержит следующие начальные этапы: 1. бактериальная клеточная культура (предпочтительным бактериальным хозяином является Е.coli, особенно предпочтительными штаммами-хозяевами являются W3110 и D1210), 2. разрушение клеток, 3. высвобождение телец включения и 4. солюбилизация телец включения.

Раскрытое изобретение было подтверждено примером с рекомбинантным GDF-5 в качестве тестового вещества. Однако в связи с необычайно высокой гомологией последовательности (см. фиг.2) способы очистки могут также применяться для очистки других GDF-5-подобных белков. Термин "GDF-5 подобные белки" включает в себя функционально подобные белки, принадлежащие к группе белков позвоночных состоящей из GDF-5, GDF-6 и GDF-7, а также их рекомбинантные варианты. Общей чертой всех GDF-5-подобных белков является наличие биологически активного домена цистинового узла с аминокислотной гомологией равной, по меньшей мере, 60% из 102 аминокислот домена цистинового узла человеческого GDF-5, и являющейся достаточной для биологической функции белка. Как видно на фиг.3, равное 60% предпочтительное предельное значение отделяет членов группы GDF-5/-6/-7 от более отдаленных белков GDF и BMP. Особенно предпочтительные белки демонстрируют аминокислотную гомологию равную, по меньшей мере, 75%, 80%, или 90% из 102 АК домена цистинового узла человеческого GDF-5.

Неограничивающими примерами GDF-5-подобных белков позвоночных и млекопитающих являются предшественники и зрелые белки человеческого GDF-5 (раскрытого как МР52 в WO 95/04819 и как человеческий GDF-5 in Hotten et al. 1994, Btochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), рекомбинантный человеческий GDF-5/МР52 (WO 96/33215), МР52 Arg (WO 97/06254); высокомолекулярный человеческий MP52s (WO 97/04095), CDMP-1 (WO 96/14335), мышиный (Mus musculus) GDF-5 (US 5,801,014), кроличий (Oryctolagus cuniculus) GDF-5 (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), куриный (Gallus gallus) GDF-5 (NCBI accession no. NP_989669), GDF-5 шпорцевой лягушки (Xenopus laevis)(NCBI accession no. AAT99303), мономерный GDF-5 (WO 01/11041 and WO 99/61611), человеческий GDF-6/BMP-13 (US 5,658,882), мышиный GDF-6 (NCBI accession no NP_038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), человеческий GDF-7/BMP-12 (US 5,658,882), мышиный GDF-7 (NCBI accession no AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WO96/143335). Изобретением также охватываются GDF-5-подобные белки, имеющие дополнительные мутации, такие, как замены, вставки и делеции, при условии, что эти дополнительные мутации не нарушают полностью биологическую активность белка. Некоторыми предпочтительными вариантами являются мутанты GDF-5-подобных белков с улучшенной биологической активностью. В которых, например, один или более остатков, обычно присутствующих в белке-предшественнике человеческого GDF-5 (см. фиг.1) заменяются на другие аминокислоты: аргинин в позиции 438 предшественника человеческого GDF-5 заменяется глицином, аланином, валином, лейцином, изолейцином, метионином или аспарагином; и/или серин 439 заменяется аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, глицином, лейцином или изолейцином; и/или аспарагин 445 заменяется серином или треонином. В другом высокоактивном мутанте, метионин 453 и/или метионин 456 заменяется аланином, валином или изолейцином. Также особый интерес представляют мутанты, в которых лейцин 441 заменяется на пролин.

Биологическая активность GDF-5-подобных белков легко может быть определена с помощью общепризнанных тестовых систем. Наиболее пригодным и предпочтительным является общепризнанный in vitro тест известный как анализ щелочной фосфатазы (Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803), который также описан в примере 5. GDF-5-подобные белки демонстрируют увеличение активности щелочной фосфатазы, например, в ROB-C26 клетках (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) как описано в WO 95/04819, в эмбриональных клетках ATDC5 (Riken Gene Bank, ROB 0565), в мышиных стромальных клетках МСНТ-1/26 и в клетках HPDL, как показано в работе Nakamura et al. 2003, J. Periodontal Res. 38, 597-605.

Следующие нелимитирующие примеры вместе с фигурами и протоколами последовательностей предназначены для дальнейшей иллюстрации изобретения.

Последовательности:

SEQ ID NO:1 является белковой последовательностью предшественника человеческого GDF-5.

SEQ ID NO:2 является последовательностью ДНК предшественника человеческого GDF-5.

SEQ ID NO:3 является белковой последовательностью зрелого человеческого GDF-5, состоящей из 120 аминокислотных остатков. Рекомбинантно-полученные белки могут также состоять из 119 аминокислотных остатков, и начинаться, таким образом, со второй аминокислоты (пролина) последовательности SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO:4 является белковой последовательностью из 120 аминокислотных остатков мономерного зрелого человеческого GDF-5. Белок может также состоять из 119 аминокислот, и начинаться, таким образом, со второй аминокислоты (пролина) последовательности SEQ ID NO:4.

На фиг.1 показаны дополнительные особенности белка-предшественника человеческого GDF-5 в соответствии с последовательностью SEQ ID NO:1:

аминокислотные остатки 001-381 - пре-продомен (жирный шрифт)

аминокислотные остатки 001-027 - сигнальный пептид (подчеркнутый жирный шрифт)

аминокислотные остатки 382-501 - фрагмент зрелого белка

аминокислотные остатки 400-501 - домен цистинового узла (подчеркнутый шрифт).

На фиг.2 показано сравнение 102 аминокислот домена цистинового узла человеческого GDF-5 (SEQ ID NO:1), человеческого GDF-6 (последовательность 2 из патента US 5,658,882) и человеческого GDF-7 (последовательность 26 из патента US 5,658,882). Аминокислотные остатки, которые являются идентичными во всех трех молекулах, выделены.

На фиг.3 показана таблица гомологии последовательностей доменов цистинового узла нескольких известных белков BMP и GDF с доменом цистинового узла человеческого GDF-5.

На фиг.4 показана карта плазмиды для экспрессии рекомбинантного зрелого человеческого GDF-5, как описано в примере 1 и (более подробно) в WO 1996/033215.

На фиг.5 показан ДСН-ПААГ электрофорез, отображающий время-зависимую фрагментацию рекомбинантного зрелого GDF-5 в течении солюбилизации в буфере для солюбилизации (8 М мочевина, 20 мМ Tris, 10 мМ ДТТ, 1 мМ Na 2 EDTA, pH 8.3). Мономерный GDF-5 уменьшается от 14 кДа до 10 кДа (фрагмент). Фрагментация почти полностью заканчивается после трех часов солюбилизации.

На фиг.6 показан ДСН-ПААГ электрофорез, демонстрирующий эффект модификации давления разрушения клеток на фрагментацию белка, выход и чистоту в соответствии с примером 2. В этой группе экспериментов, давление разрушения равное 560 бар (верхняя картинка) сравнивается с давлением разрушения равным 850 бар (нижняя картинка). Более высокое давление, равное 860 бар, ведет к значительному уменьшению фрагментации белков и к более высоким выходу/чистоте белка.

На фиг.7 и 8 показан ДСН-ПААГ электрофорез, демонстрирующий эффекты различных буферов для солюбилизации на фрагментацию мономерного GDF-5, растворенного в буфере для солюбилизации. Составы буферов приведены в примере 3.

На фиг.9 показан профиль зависимости растворимости зрелого GDF-5 от pH.

На фиг.10 показаны модификации способа получения GDF-5 в соответствии с изобретением.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Пример 1. Получение и очистка рекомбинантного GDF-5

(1) Конструирование экспрессирующего вектора и трансформация Е. coli

Конструирование системы плазмидных векторов для получения зрелого рекомбинантного человеческого GDF-5 (аминокислотные остатки с 1 по 119 последовательности Seq ID No. 3) и трансформация штамма-хозяина Е. coli W3110 (W3110M) проводили, как описано в примере 1 WO 1996/033215.

(2) Культивирование в Е. coli.

Е. coli, экспрессирующие белок изобретения, прекультивировали в модифицированной среде SOC (20 г/л Бактотриптона, 5 г/л Бактодрожжевого экстракта, 0,5 г/л NaCl, 2,03 г/л MgCl 2 ×6H 2 O, 3,6 г/л глюкозы). 100 мл бактериальной суспензии инокулировали 5 литров среды для продуцирования (5 г/л Бактотриптона, 4.3 г/л Лимонной кислоты, 4,675 г/л K 2 HPO 4 , 1,275 г/л KH 2 PO 4 , 0,865 г/л NaCl, 100 мг/л FeSO 4 ×7H 2 O, 1 мг/л CuSO 4 ×5H 2 O, 0,5 мг/л MnSO 4 ·×nH 2 O, 2 мг/л CaCl 2 ×2H 2 O, 0,225 мг/л Na 2 B 4 O 7 ×10H 2 O, 0,1 мг/л (NH 4) 6 Mo 7 O 24 ×4H 2 O, 2,25 мг/л ZnSO 4 ×7H 2 O, 6 мг/л CoCl 2 ×6H 2 O, 2,2 г/л MgSO 4 ×7H 2 O, 5,0 мг/л Тиамин HCl, 3 г/л глюкозы), которую культивировали в 10-литровом ферментере с аэрацией-перемешиванием, и затем, по достижении ранней стадии логарифмической фазы роста (OD 550=5.0), добавляли изопропил-бета-D-тио-галактопиранозид в конечной концентрации 1 мМ и продолжали культивирование до достижения OD 550=150. В процессе культивирования температура поддерживали на уровне 32°C, а pH поддерживали с помощью аммиака на уровне 7.15. В целях предотвращение снижения концентрации растворенного кислорода, перемешивание проводилось при повышенной скорости, для того чтобы удержать уровень концентрации растворенного кислорода равным 50% от его содержания в атмосфере. Продолжили культивирование с добавлением 50% раствора глюкозы до уровня 0,2% для получения высокой плотности клеток, с указанием резкого увеличения концентрации растворенного кислорода.

(3) Приготовление телец включения из Е. coli

Культуральную жидкость, полученную способом, описанным выше, отцентрифугировали для сбора клеток, которые затем ресуспендировали в 25 мМ Tris-HCl, содержащем 10 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту (pH 7.3). Клетки разрушали гомогенизатором высокого давления и центрифугировали снова для сбора содержащего тельца включения преципитата.

(4) Отмывка и солюбилизация телец включения из Е. coli

После 3-кратной отмывки (например, с помощью 1% Тритона Х-100) тельца включения E. coli центрифугировали при 3000 g 30 минут при 4°С, и затем полученный преципитат солюбилизировали ультразвуком в буфере для солюбилизации (20 мМ Tris-HCl буфер, 8 М мочевина, 10 мМ DTT, and 1 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3). В связи с наблюдаемой частичной деградацией белка GDF-5 из телец включения в содержащих мочевину буферах (см. фиг.5) также были протестированы различные дополнительные буферы для солюбилизации, описанные в примере 3.

(5) Приготовление мономеров

Солюбилизированный раствор центрифугировали при 20000 g 30 минут, при 4°С и образовавшийся супернатант собирали. Полученный супернатант нанесли на колонку с SP-Sepharose FF (Pharmacia AB), уравновешенную буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCl, pH 8.3, 6М мочевину и 1 мМ EDTA, и затем, после отмывки таким же раствором, искомое элюировали таким же раствором, содержащим 0,5 М NaCl. Белок в элюате сульфировали путем добавления Na 2 SO 3 и Na 2 S 4 O 6 до конечной концентрации соответственно 111 мМ и 13 мМ и инкубировали при 4°C а течении 15 часов. Сульфированный раствор подвергали гель-фильтрации на колонке с Sephacryl S-200 HR (Pharmacia AB), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ Tris-HCl, рН 8,3, 6 М мочевину, 0.2 М NaCl, and 1 мМ EDTA для получения очищенных, сульфированных мономеров белка изобретения.

(6) Рефолдинг

Раствор сульфонированных мономеров добавляли к девяти объемам буфера, содержащего 50 мМ натриевой соли глицина, pH 9,8, 0,2 М NaCl, 16 мМ CHAPS, 5 мМ EDTA, 2 мМ GSH (восстановленная форма глутатиона) и 1 мМ GSSG (окисленная форма глутатиона) при помешивании и затем инкубировались 24 часа при 4°С для окисления и рефолдинга белка изобретения.

(7) Приготовление гомодимеров

Раствор для рефолдинга разбавляли таким же объемом очищенной воды и затем добавлением 6 N NaCl корректировали значение pH до примерно 7,4 и подвергали изоэлектрической преципитации. Преципитат, собранный центрифугированием при 3000 g в течение 20 минут, солюбилизировали в растворе 30% ацетонитрила, содержащем 0,1% TFA. Раствор разбавляли таким же объемом очищенной воды и наносили на колонку RESOURCE RPC (Pharmacia AB) для обратнофазной ВЭЖХ заранее уравновешенную 25% ацетонитрилом, содержащим 0,05% TFA и затем элюировали линейным градиентом 25-45% ацетонитрила, содержащего 0,05% TFA. Элюат отслеживали по поглощению при 280 нм. Фракции очищенного гомодимерного белка собирали и лиофилизировали с помощью SpeedVac Concentrator (Servant Co.). Опционально, очищенный белок подвергали конечному этапу ультра-/диафильтрации.

Пример 2. Вариант I - Модификация давления разрушения клеток

Было проведено несколько экспериментов с различными давлениями разрушения клеток, для того, чтобы оценить эффект разрушения клеток на выход/деградацию белка, чистоту и фильтруемость, Биомассу после каждого культивирования ресуспендировали в буфере для гомогенизации (25 мМ Tris, 10 мМ Na 2 EDTA, pH 7,3), гомогенизировали и перемешивали в течение от 30 до 60 минут с помощью магнитной мешалки. Далее, суспензию биомассы трижды разрушали в гомогенизаторе высокого давления при различных давлениях разрушения. Полученные тельца включения промывали промывочным буфером (20 мМ Tris, 5 мМ Na 2 EDTA pH 8,3) и хранили при <-70°C. После оттаивания в течение ночи при +4°C, тельца включения растворяли в предварительно охлажденном буфере для солюбилизации, содержащем 6 М мочевину и 0.5 М L-аргинин, гомогенизированы и снова перемешаны с помощью магнитной мешалки в течение от 30 до 60 минут. После этого раствор телец включения центрифугировали в течение 30 минут при 10°C, при динамической нагрузке 10000 g (=7500 оборотов в минуту). Супернатант декантировали для отделения телец включения от нерастворимых компонентов, фильтровали через объемный фильтр (CUNO Zeta Plus BC0030A90ZA08A). Затем фильтрат фильтровали снова через стерилизующий фильтр (Nalgene Bottle Top Filter 0.2 мкм). Стерильный фильтрат сконцентрировали и дифильтровали против катионообменного буфера А (6 М мочевина, 20 мМ Tris, 1 мМ Na 2 EDTA, 50 мМ NaCl, 10 мМ DTT, pH 8,3) перед загрузкой в катионообменную колонку. Тестовые образцы, полученные на различных этапах, анализировали с помощью известных аналитических тестовых методов, таких как ДСН-ПААГ электрофорез, окраска красителем Coomassie-Brilliant-Blue, и основанных на ИФА методов для определения белков Е. coli.

Результаты этого исследования (см. фиг.6) показывают, что значительные улучшения первичного способа очистки могут быть достигнуты в случае, если разрушение клеток проводится при давлении разрушения между 800 и 900 бар. Таким образом, получаются тельца включения улучшенного качества, что приводит к более высокому соотношению рекомбинантного GDF-5 к общему белку (например, 57% при 850 бар, против 35% при 560 бар) и уменьшению содержания белков Е. coli в конечном продукте (например, <30 мкг/мг при 850 бар, против >50 мкг/мг при 560 бар). Эти улучшения также полезны для фильтруемости. Необходимая площадь фильтра для производственных масштабов может быть сокращена (например, с теоретической 2,6 м 2 при 560 бар, до <1 м 2 при 850 бар) в больших масштабах. Это приводит к сокращению времени способа, уменьшенной фрагментации белка и сокращению соответствующих издержек при получении рекомбинантного GDF-5.

Пример 3. Вариант II - Солюбилизация телец включения

В целях предотвращения деградации GDF-5 и подобных белков, стандартный этап солюбилизации телец включения такой как, например, описан в примере 1, изменили в различных аспектах. Усилия были направлены на эксперименты для выявления/ингибирования потенциальной протеолитической активности, а также на поправки композиции буфера для солюбилизации как описано в примере 1 (например, pH, мочевины, Na 2 EDTA and DTT, гуанидин HCl, аминокислот, таких как L-аргинин).

(3.1) Эксперименты по ингибированию протеаз

(3.1.1) Химическое ингибирование

В этой серии экспериментов использовали коктейль протеазных ингибиторов. В подгруппе, тельца включения дополнительно ресуспендировали в течение 20 минут в 25% HCl (pH 2,7) в целях инактивации протеаз, связанных с внешней клеточной стенкой. После 3-х кратной отмывки, 8 г телец включения с рекомбинантным человеческим GDF-5 растворяли в 50 мл стандартного буфера для солюбилизации, содержащего 8 М мочевину. 2 таблетки, содержащие смесь протеазных ингибиторов (Roche Diagnostics Protease Inhibitor Cocktail Tablets Cat. No. 11 697 498 001), добавляли и тщательно смешивали с раствором телец включения. После 1,5 ч и 3 ч инкубации при комнатной температуре, образцы центрифугировали и анализировали. Рекомбинантный GDF-5 обнаружили в значительной степени деградированным во всех группах, демонстрируя тем самым, что химическое ингибирование белковой деградации с помощью HCl и ингибиторов протеаз не эффективно.

(3.1.2) Термическая инактивация

После 3-кратной отмывки 15 г телец включения с рекомбинантным человеческим GDF-5 растворяли в 100 мл буфера, содержащего 10 мМ Na2EDTA, 25 мМ Tris (pH 7,3). Термическая инактивация проводили с помощью инкубации при 65°C в течение различных периодов времени (от 20 мин до 2 часов). Затем, образцы подвергли стандартному этапу солюбилизации, описанному в примере 1. Результаты: несмотря на термическую инактивацию протеаз, рекомбинантный GDF-5 деградировал в во всех этих образцах.

(2) Коррекция композиций буферов для солюбилизации.

Попытки уменьшить фрагментацию GDF-5-подобных белков модификацией используемого буфера для солюбилизации были успешными. Некоторые из протестированных буферов для солюбилизации перечислены ниже:

Буферы с мочевиной:

Стандартный: 8 М мочевина, 20 мМ Tris, 10 мМ DTT 1 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер U1: 8 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 50 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер U2: 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 50 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер U3: 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер U4: 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA 50 мМ NaCl, pH 8,3

Буфер U5: 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 9,5

Буферы с L-аргинином:

Буфер А1: 100 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер А2: 30 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, рН8,3

Буфер A3: 10 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер А4: 1 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер А5: 200 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8,3

Буфер А6: 100 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 9,5 Buffer A7: 500 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 9.5 Buffer A8: 500 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8.3 Buffer A9: 300 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8.3

Буфер А10: 400 мМ аргинин, 6 М мочевина, 20 мМ Tris, 64 мМ DTT, 5 мМ Na 2 EDTA, pH 8.3

Для проверки деградации, 0,1 г телец включения с GDF-5 смешали с 0,9 мл буфера для солюбилизации. Деградация проверяли после 4-5 часов инкубации телец включения, растворенных в буфере для солюбилизации. Результаты анализировали с помощью ДСН-ПААГ электрофореза и последующей окраски Coomassie Brilliant Blue.

Результаты: Среди прочего, были достигнуты следующие результаты в ходе тестов на деградацию:

Na 2 EDTA: увеличение концентрации от 1 до 5-50 мМ ведет к незначительному уменьшению деградации

PH: изменение от 8,3 до более высоких значений (между 9,0 и 11,0) ведет к уменьшению деградации, а также к увеличению общего количества белка. Например, повышение pH от 8,3 до 9,5 в буферах для солюбилизации (см., например, буферы A7 и A8 на фиг.7) улучшило и общее количество белка и степень деградации. Даже если тельца включения растворить в буферах с малым количеством L-аргинина, то после 5 часов инкубации при комнатной температуре при повышенном pH эти буферы все еще содержат рекомбинантный GDF-5 (см., например, буфер А6 на фиг.7).

DTT: Неэффективные изменения

Аминокислоты, особенно L-аргинин: Следующие первоначальные результаты были получены с буферами для солюбилизации, содержащими от 0 до 100 мМ L-аргинина (pH 8.3):

использованный буфер	время инкубации	деградация рекомбинантного GDF-5
Буфер без аргинина	инкубация 0 ч	практически полная
		практически полная
Буфер А1	инкубация 0 ч	около 50%
	инкубация 4 часа при комнатной температуре	около 50%
Буфер A3 (30 мМ L-Арг, pH 8,3)	инкубация 0 ч	около 50%
	инкубация 4 часа при комнатной температуре	практически полная
Буфер А2(10 мМ L-Арг, pH 8,3)	инкубация 0 ч	около 50%
	инкубация 4 часа при комнатной температуре	практически полная
Буфер А4 (1 мМ L-Apr, pH 8,3)	инкубация 0 ч	Деградация меньше, чем в контрольном образце
	инкубация 4 часа при комнатной температуре	практически полная

В последующих экспериментах использовали повышенную концентрацию L-аргинина. Время инкубации было увеличено до 5 часов. В рамках этого эксперимента тестировали влияние а) повышенной концентрации L-аргинина в буфере для растворения и б) смещения pH в сторону более щелочных условий на деградацию рекомбинантного GDF-5. Были получены результаты:

использованный буфер	общий белок, мг/мл	рекомбинантный GDF-5, мг/мл	соотношение рек. GDF-5 (рек. GDF-5/общий белок)	Деградация рек. GDF-5
Буфер без Арг (pH 8,3)	5,92	рек. GDF-5 не обнаружен 1)	рек. GDF-5 не обнаружен 1)	практически полная 2)
Буфер без Арг (pH 9,5)	7,79	рек. GDF-5 не обнаружен 1)	рек. GDF-5 не обнаружен 1)	практически полная 2)
Буфер А6 с 100 мМ Арг (pH 9,3)	10,03	3.31	33%	почти никакой
Буфер А5 с 200 мМ Арг (pH 8,3)	7,62	1,64	22%	около 50% 2)
Буфер А9 с 300 мМ Арг (pH 8,3)	7,59	3,34	44%	почти никакой 2)
Буфер А10 с 400 мМ Арг (pH 8,3)	7,29	3,57	49%	почти никакой 2)
Буфер А7 с 500 мМ Арг (pH 9,5)	11,12	5,17	47%	почти никакой 2)
Буфер А8 с 500 мМ Арг (pH 8,3)	7,68	4,76	62%	почти никакой 2)
1) Значения вне калибровки
2) Уровень деградации визуально оценивали с помощью ДСН-ПААГ электрофореза

В соответствии с количественной оценкой, уровень деградации четко уменьшается с увеличением концентрации аргинина в буферах для солюбилизации (таблица выше и фиг.7 и 8). Однако остается еще некоторый уровень деградации рекомбинантного GDF-5 при использовании 400 мМ аргинина (в буфере для растворения) А10. Почти никакого (деградированного) рекомбинантного GDF-5 не найдено в гранулах телец включения, если судить визуально по ДСН-ПААГ электрофорезу и по количественной оценке. Таким образом, растворимость рекомбинантного GDF-5 в содержащих аргинин буферах для солюбилизации хороша. Доля рекомбинантного GDF-5 увеличилась с повышением концентрации L-аргинина в буферах для солюбилизации. Наилучшая доля рекомбинантного GDF-5, составляющая 62%, может быть достигнута с помощью аргинин-содержащего буфера для растворения А8 (500 мМ L-аргинина). Концентрация равная, по меньшей мере, 500 мМ L-аргинина в буфере для солюбилизации телец включения считается оптимальной для получения рекомбинантного GDF-5 и подобных ему белков.

Пример 4. Влияние L-аргинина на ионообменную хроматографию

Цель данного эксперимента заключалась в проверке влияния содержания L-аргинина в буфере для солюбилизации телец включения на последующую очистку белка ионообменной хроматографией.

Различные образцы телец включения, полученных культивированием, после солюбилизации наносили на катионообменную колонку, состоящую из хроматографического носителя SP Sepharose FF упакованного в колонку ХК 16/20 (CV=28 мл). Тестируемые буферы содержали (помимо других описанных компонентов) 8 М мочевину без L-аргинина (стандартный буфер для солюбилизации) или 6 М мочевину с 500 мМ L-аргинином (модифицированный буфер для солюбилизации).

Тельца включения получали разрушением продуцирующих GDF-5 клеток Е. coli с помощью гомогенизатора высокого давления (три цикла, 850 бар) и последующей двукратной отмывкой. 10,37 г полученных телец включения растворяли в 100 мл модифицированного буфера для солюбилизации (буфер с 6 М мочевиной, содержащий 0,5 М аргинин). 80 мл раствора с тельцами включения осталось после центрифугирования, тупиковой фильтрации и стерилизующей фильтрации телец включения. 40 мл фильтрованного раствора с тельцами включения наносили в неразбавленном виде на катионообменную колонку (примерно 172,4 мг общего белка). Анализировали содержание общего белка и рекомбинантного GDF-5 в элюате, отмывке и фракциях обоих запусков катионообменной хроматографии.

Результаты: Из-за измененной проводимости модифицированного буфера для солюбилизации (18 mS/cm вместо 5 mS/cm стандартного буфера для солюбилизации), связывание с носителем катионообменной колонки в модифицированном буфере не является полным. С модифицированным буфером для солюбилизации возможно только неполное связывание с носителем катионообменной колонки (выход белка 10% вместо 60%). Следовательно, необходимы дополнительные этапы для замены буфера (например, диафильтрация через 5 кДа целлюлозную мембрану) перед катионообменной хроматографией.

Пример 5. Тестирование биологической активности по щелочной фосфатазе

Биологическая активность GDF-5-подобных белков и их коллоидных композиций может быть легко определена с помощью общепризнанных тестовых систем. Самым удобным и предпочтительным является обычный анализ щелочной фосфатазы (Takuwa et al. 1989, Am. J. Physiol. 257, E797-E803). В этой in vitro тестовой системе, биологическая активность GDF-5-подобных ростовых факторов измеряется после кокультивации различных концентраций белка с остеогенными/хондрогенными клетками. GDF-5 и подобные белки с остео/хондрогенным потенциалом повышают экспрессию щелочной фосфатазы в таких клетках, например, в клетках ATDC-5, ROB-C26 или МСНТ-1/26. Активность щелочной фосфатазы в этих клеточных лизатах определяется колориметрическим анализом. Реакция основана на гидролизе р-Нитрофенилфосфата (PNPP) и превращении его в р-Нитрофенол, который становится видимым в щелочных условиях, в виде желтого р-Нитрофениланиона. Цель заключалась в измерении активности тестируемых LMP-композиций и сравнении с активностью щелочной фосфатазы, вызванной известными концентрациями эталонного GDF-5.

В стандартизованном анализе щелочной фосфатазы, 1×10 4 клеток клеточных линий ATDC-5, МСНТ 1/26 инкубировали в течение ночи в 96-лучном планшете в культуральной среде (альфа-МЕМ, Пенициллин/Стрептомицин, 2 мМ L-глутамин, 10% ФТС) при 37°С, 5% СО 2 , в насыщенной водой атмосфере). На следующий день клетки стимулировали GDF-5-подобными белками или их композициями в течение 72 часов с указанными концентрациями лигандов. Клетки впоследствии отмывали фосфатно-солевым буферным раствором. Лизис клеток проводили в 100 мкл щелочного буфера для лизиса 1 (0,1 М глицин, pH 9,6, 1% NP-40, 1 мМ MgCl 2 , 1 мМ ZnCl 2) в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли 100 мкл щелочного буфера для лизиса 2 (0.1 М глицин, pH 9,6, 1 мМ MgCl 2 , I мМ ZnCl 2 +2 мг/мл PNPP). Планшеты инкубировали при 37°С, 5% CO 2 , в насыщенной водой атмосфере. Затем реакция щелочной фосфатазы останавливали с помощью 100 мкл раствора 30 г/л NaOH и, наконец, оптическая плотность измеряли с помощью автоматического планшетного ридера при длине волны 405 им с вычитанием холостой пробы.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения очищенного рекомбинантного GDF-5-подобного белка, который включает стадии разрушения рекомбинантных бактериальных клеток E.coli, экспрессирующих GDF-5-подобный белок, и солюбилизации телец включения для получения солюбилизированного мономера GDF-5-подобного белка, в котором:

a) разрушают указанные клетки E.coli с помощью гомогенизатора высокого давления при давлении разрушения от 800 до 900 бар;

b) выделяют тельца включения из разрушенных клеток E.coli центрифугированием;

c) обрабатывают выделенные тельца включения денатурирующим буфером для солюбилизации, содержащим мочевину и L-аргинин; и

d) очищают солюбилизированный мономер рекомбинантного GDF-5-подобного белка центрифугированием и хроматографией.

2. Способ по п.1, в котором буфер для солюбилизации содержит 4-8 М мочевину и 400-500 мМ аргинин, предпочтительно 6 М мочевину и 500 мМ аргинин.

3. Способ по п.1, в котором буфер для солюбилизации содержит хелатор в концентрации от 5 до 100 мМ.

4. Способ по п.1, в котором буфер для солюбилизации имеет pH между 9,0 и 11,0.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий удаление высокомолекулярных примесей непосредственно после этапа солюбилизации телец включения путем применения одного или более способов, выбранных из группы, состоящей из центрифугирования, объемной фильтрации и стерилизующей фильтрации.

6. Способ по п.1, дополнительно включающий удаление с помощью диафильтрации упомянутого L-аргинина из раствора, содержащего солюбилизированный белок телец включения.

7. Способ по п.1, в котором рекомбинантные бактериальные клетки E.coli, экспрессирующие GDF-5-подобный белок в тельцах включения, выбраны из E.coli D1210 и E.coli W3110.

Тема 3. Индикация вирусов в патологическом материале по обнаружению вирионов и вирусных телец-включений

Задание к следующему занятию

Подведение итогов занятия

Контрольные вопросы:

1. Каковы общие правила взятия материала от больных животных и трупов?

2. Как консервируют и транспортируют патологический материал?

3. Что вы знаете о подготовке патологического материала к исследованию?

Цель занятия: ознакомить студентов с методами прямого обнаружения вируса в исследуемом материале. Освоить технику приготовления мазка из вируссодержащего материала и методику окраски мазков по Морозову. Ознакомиться с устройством и принципом работы электронного и люминесцентного микроскопов. Изучить приготовление препаратов для просмотра в электронном микроскопе.

Оборудование и материалы: световые микроскопы, вируссодержащий материал, предметные стекла, спиртовки, фильтровальная бумага, эксикаторы, мостики, промывалки с дистиллированной водой, песочные часы, жидкость Руге, протрава, красящий раствор аммиачного серебра, электронный и люминесцентный микроскопы, схема строения электронного микроскопа, фотографии вирусов под электронным микроскопом, фоторепродукции вирусов в поле люминесцентного микроскопа (РИФ), мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point и плакаты по теме занятия.

Объяснение преподавателя: Вирусы находящиеся в живых клетках одно- и многоклеточных организмов представлены чаще всего в виде скоплений не связанных между собой молекул (или частей молекул) РНК или ДНК, в которых закодирована генетическая информация о вирусных белках. В результате реализации этой информации в тех же клетках синтезируются и накапливаются молекулы вирусных белков. Внутри клеток все вирусные молекулы (ДНК, РНК, белки) защищены от разрушительного действия внеклеточных факторов (ферментов, кислот, температуры, излучений и др.). Если же вирусы оказываются вне клеток, то быстро разрушаются.

3.1 Методы прямого обнаружения вируса в исследуемом материале. Многие вирусные белки, которые называются структурными, обладают свойством самопроизвольно под действием межмолекулярных сил собираться в комочки, агрегаты (процесс самосборки). В каждый такой агрегат включается обычно по одной молекуле вирусных ДНК или РНК. Иногда в них могут включаться еще и липиды клеточного происхождения. Образующиеся таким путем частицы называются вирионами. В вирионах молекулы белков так взаимно ориентированы, что на них не могут действовать протеолитические ферменты, а молекулы вирусных ДНК или РНК оказываются недоступными для нуклеаз и защищенными ох действия физических факторов среды. Формирование вирионов каждого отдельного вируса возможно только в клетках определенного типа.

Вирионы можно рассматривать как покоящуюся неактивную форму существования вирусов. Поэтому в форме вирионов вирусы могут определенное время находиться и вне клеток без потери биологической активности.

Крупные вирусы (оспа, эктима), видимые в иммерсионной системе светового микроскопа получили название элементарные тельца.

Внутриклеточные тельца-включения – это обломки скоплений вирусных частиц или продукт реакции клетки на вирусную инфекцию. Их классифицируют по месту локализации в клетке, по гомогенности, по составу нуклеиновой кислоты, по тинкториальным свойствам.

При ряде вирусных инфекций обнаружение телец - включений имеет диагностическое значение. Многие из них настолько типичны, что обнаружение их стало одним из основных экспресс-методов диагностики бешенства, оспы, ринопневмонии лошадей, ринотрахеита крупного рогатого скота.

3.2 Методы окраски вирионов. Существует много методов окраски мазков, мазков - отпечатков. Самым распространенным является метод окраски по Морозову. Метод окраски прост, не требует дефицитных реактивов, выполним на занятиях.

Приготовленные мазки сушат на воздухе, помещают в вертикальном положении в дистиллированную воду на 10-15 минут и красят. Для окраски по Морозову готовят три реактива.

1) жидкость Руге.

2) протраву

3) красящий раствор аммиачного серебра.

Рассматривают препарат в иммерсионной системе. Элементарные тельца на светло - коричневом фоне препарата имеют вид темно - коричневых почти черных мелких зерен, образований.

Тельца-включения, образуемые рядом вирусов, получили специальные названия. Так, цитоплазматические тельца - включения, образуемые в нервных клетках млекопитающих вирусом бешенства, называют тельца Бабеша-Негри, в эпителиальных клетках овец - вирусом оспы овец - тельца Борреля, вирусом оспы кур - тельца Болингера. Как правило, РНК-содержащие вирусы образуют цитоплазматические, а ДНК-содержащие – внутриядерные тельца-включения Небольшая группа вирусов вызывает образование телец-включений обоих типов. Наибольшее практическое значение приобрели тельца Бабеша-Негри в диагностике бешенства. Из кусочков определенных отделов головного мозга (Аммоновых рогов, мозжечка, продолговатого мозга) готовят гистологические срезы. Полученные препараты окрашивают по методу Муромцева, Туревича, Селлерса и др. Каждый метод окраски дает свою характерную картину.

3.3 Устройство и принципы работы электронного и люминесцентного микроскопов. При любых микроисследованиях необходимо именно точные сведения о морфологических особенностях интересующего нас организма. Эти сведения не могут быть получены иначе, как путем изучения данного организма под микроскопом. В силу этого микроскоп становится важнейшим орудием для практического изучения микроорганизмов, и знакомство с ним является первым условием успеха в этой работе.

Целью различных видов микроскопии являются дальнейшее изучение морфологии вирусов и дифференциальная диагностика инфекционных болезней. По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому. В отличие от светового в электронных микроскопах изображение получается с помощью потока электронов.

Пучок электронов проходит через исследуемый препарат и его изображение проецируется на люминесцентный экран. Источником электронов является электронная пушка (вольфрамовая нить), нагреваемая электротоком. Электроны ускоряются и направляются вниз по колонке, проходя через несколько магнитных линз (конденсорная, объективная, проекционная). На экране возникает видимое изображение объекта, которое можно сфотографировать или просматривать на экране монитора (рис.7).

Чтобы предотвратить поглощение электронов воздухом, из микроскопа откачивают воздух вакуум - насосом.

Основные части микроскопа: колонка, панель управления, пишущее устройство, вакуумная система, соединительные кабели. В нижней части электронного микроскопа расположены масляные и диффузные насосы.

Максимальная разрешающая способность электронного микроскопа 2А°. По характеру исследования объектов различают микроскопы просвечивающего типа, сканирующие, эмиссионные, теневые.

При работе с электронным микроскопом важное значение имеет подготовка препаратов. Для просвечивающего электронного микроскопа исследуемые объекты должны быть в виде тонких срезов или вирусных суспензий. Объекты помещают на медные сеточки с подложками.

3.4 Методы подготовки препаратов: метод негативного контрастирования, метод отпечатков, метод напыления, метод ультратонких срезов.

Материалом для электронно-микроскопических исследований вирусов могут быть смывы со слизистых оболочек, содержимое кишечника, кожные поражения, корочки, кусочки органов и тканей, аллантоисная жидкость куриного эмбриона, вируссодержащая культуральная жидкость культуры клеток. При подготовке препаратов большое значение имеет концентрация вируса в материале и степень его контаминации балластными веществами. В зависимости от этих факторов и выбирают методику подготовки исходного материала.

С помощью электронного микроскопа в отдельных случаях в считанные минуты по морфологии вирусных частиц можно определить таксономическое положение вируса.

Метод иммунофлуоресценции называют еще РИФ, метод меченых антител.

Принцип РИФ основан на использовании явления флюоресценции, который состоит в испускании света атомами вещества, поглотившими избыточную внешнюю энергию и пришедшими в состояние возбуждения. При этом используют люминесцентную микроскопию (рис. 7)

Рисунок 7. Люминесцентный микроскоп МЛ-2

В диагностических исследованиях методом РИФ в качестве объекта исследования могут быть мазки – отпечатки, срезы органов и тканей, соскобы, гистологические срезы, препараты тканевых культур.

При прямом методе РИФ мазок - отпечаток обрабатывают сывороткой, меченной антителами, гомологичными тому вирусу, наличие которого предполагается. Если в мазке содержится антиген, гомологичный антителам сыворотки, то образуется комплекс антиген + антитело. Препараты отмывают, сушат и исследуют под люминесцентным микроскопом, который устроен так, что на препарат падает пучок сине-фиолетовых лучей, а в глаз наблюдателя попадают только желто-зеленые лучи, которые испускает комплекс антиген + антитело. По этому свечению и судят о наличии в материале антигенов, гомологичных антителам меченой сыворотки.

Непрямой метод состоит в том, что мазок - отпечаток обрабатывают дважды: вначале немеченой антивирусной сывороткой, а затем после отмывания - меченной антивидовой. После второго отмывания препарат высушивают и исследуют под люминесцентным микроскопом. Обнаружение в препарате специфической флюоресценции указывают на наличие в материале антигенов, гомологичных использованной противовирусной сыворотке.

По эффективности непрямой метод имеет преимущества перед прямым методом.

В целом метод флюоресцирующих антител обладает рядом достоинств перед другими методами.

.
Синтетичность - одновременно в одном событии реализуются программы достижения всех положительных ценностей и избегания отрицательных. Синтетический канал плохо поддаётся рационально-аналитическому пониманию и толкованию.

ЦЕННОСТИ → ЦЕПОЧКИ СОБЫТИЙ

Программы достижения ценностей. Жизненные ценности (Буддхи) формируют единую цепочку событий (Каузальное Тело), последовательный поток событий.
Включение Тельца - зарождают новые цепочки событий и старые начинают идти более интенсивнее.

Куски событийного потока, посвящённые достижению различных ценностей, переплетаются столь непредсказуемым, а главное, столь причудливым образом, что часто бывает трудно сказать, к какой программе относится данное событие или поступок. Чем выше уровень сознания человека, тем больше связей-горизонтальных и вертикальных-он просматривает в мире и собственном организме, тем труднее ему относить события к определённым ценностям и программам их достижения и тем лучше он видит истинную синтетичность Тельца, выражающуюся в том, что создаваемые им событийные семена представляют собой синтез одновременно всех ценностей человека, причём как осознаваемых, так и неосознанных.

Материал на котором происходят события и их основное содержание приходит сверху, из картины мира и ценностей человека как воплощение программ их достижения. Телец ориентирует человека на конкретную деятельность, создавая ему проблемы и вдохновляя на их решение. Большая часть собственных ценностей (как положительных, так и отрицательных) человеком не осознаётся, и потому программы их достижения (избегания) материализуются помимо его сознания. Формируя поток событий (внешних и внутренних), Телец заставляет человека принимать в себя плотные остатки душевная деятельность (буддхиальной работы плоды). Зарождение события всегда символизирует эпилог некоторого душевного переживания.

Процесс обучения - чисто буддхиальный процесс. Каузальное Тело владеет кратковременной памятью. Если в процесс обучения вкрадывается каузальная "цель", то есть студент начинает думать собственно об экзамене, происходит соскальзывание на Каузальный План и начинается халтура: мгновенно возникает мысль о шпаргалке, появляется искушение побольше запомнить, не разбираясь в существе вопроса, и т.п. "Вся жизнь человека в большой степени воспринимается им как последовательность экзаменов и периодов подготовки к ним".
Главный признак окончания буддхиальной программы - ощущение глубокого обновления человека, расставания со старой жизнью и картиной мира и обретение новых, в которых он чувствует себя более цельным и лучше ощущает своё место в мире и обязанности перед ним.

Буддхиально-ориентированные люди.
Люди с сильным Буддхиальным и слабым Каузальным Телами живут очень напряжённой душевной жизнью и мало заинтересованы в конкретных событиях. Это, например, люди, посвятившие себя одной идее и видящие смысл жизни только в ней самой по себе,- это типично для пассионариев. Бывают также люди, интересующиеся исключительно психологической подоплёкой событий или скрытыми главными линиями их развития и равнодушные к конкретным фактам и обстоятельствам, причём это относится не только к чужой жизни, но и к собственной. Они часто не замечают событий, явно противоречащих их представлениям о мире, и вообще не склонны связывать свою сущностную картину мира с какими-либо её манифестациями. Их позиция такова: мало ли что может случиться, это ещё ничего не доказывает. Эти люди более духовны, чем каузально-ориентированные.
Буддхиально-ориентированный человек с плохо проработанным Тельцом не думает о событийные отметках даже в тех случаях, когда происходят очевидно важные для него события. Для него конкретная цель не более чем повод для определённых душевных переживаний, утверждения своей картины мира и главных жизненных ценностей. Если его жизненные позиции нигилистичны, он способен взяться за заведомо проигрышное мероприятие и не особенно огорчится, когда оно провалится: он только лишний раз утвердился в своём фундаментальном мнении, что в этом мире ничего хорошего сделать нельзя.
Буддхиально-ориентированный человек, как правило, считает работу Тельца излишней и чрезмерной, тем более что тратить силы на выращивание событий ему жалко и некогда.

Каузально-ориентированные люди.
Люди со слабым Буддхиальным и сильным Каузальным Телами считают главное в жизни - поток конкретных событий, а "психология" и "подоплёка" несущественны. У них имеются буддхиальные ценности и реализуются программы их достижения, но основной интерес представляют манифестации этапов достижения этих ценностей. Их больше интересует, что происходит, нежели почему оно происходит, и Идеалом часто служит "разнообразная, насыщенная интересными людьми и событиями жизнь".
Каузально-ориентированный человек с плохо проработанным Тельцом по природе практик: он видит цели своих усилий как вполне определённые события и всё происходящее с ним оценивает как определённые шаги, приближающие его к цели или удаляющие от неё. Для такого человека характерно отношение к времени как к отрицательному фактору: его душевные силы уходят главным образом на то, чтобы преодолеть свои негативные ощущения, связанные с тем, что желаемое событие всё никак не происходит и его ещё предстоит долго ждать. Когда же желаемое событие наконец происходит, оно не приносит особой радости или, эта радость оказывается существенно меньше тех неприятностей и преодолённого напряжения, которые были по пути.
Каузально-ориентированный человек чаще всего с радостью приветствует тельцовскую работу (зарождаются новые цепочки событий и старые начинают идти более интенсивнее) и обычно считает потоки Тельца недостаточными и вечно запаздывающими.
Телец считается самым упрямым знаком Зодиака и от него сложно добиться, чтобы событие произошло, когда буддхиальная подготовка ещё не завершилась. И очень сложно остановить события, когда буддхиальная энергия уже поступила в канал Тельца.
Внешние буддхиальные программы (воспитание детей, продвижение по социальной лестнице, сохранение здоровья, участие в политической жизни общества) сопровождаются возникновением новых цепочек событий лишь тогда, когда частично заходят в тупик и требуется некоторая буддхиальная расчистка; тогда включается Телец, синтезирующий из остатков буддхальной работы семена будущих событий и энергию, необходимую для их выращивания. Типичный пример такой цепочки событий - перемена места работы. Необходимость в ней возникает тогда, когда постоянно идущие программы социализации и профессионального роста вступают в противоречие друг с другом или с иными ценностями человека. Если противоречие успешно решается на буддхиальном уровне и человек находит конструктивный компромисс, необходимость в перемене места работы не возникает. Когда наступает момент, когда программа работы на данном месте кончается, превращаясь (через канал Тельца) в эпизоды решительного и бесповоротного расставания. Если ценность данного места работы ещё не высохла, то человек чувствует, что его сюжет на этой работе в основном окончен, но уволиться по "объективным" причинам никак не может, хотя дальнейшее пребывание для него мучительно и никчемно. Когда увольнение, наконец про-исходит, оно переживается как огромное событие.

Энтузиазм (душевные силы), предназначенный на преодоление отрезка трудного буддхиального развития, расходуется по мере прохождения этого пути, и к его концу обычно не остаётся ничего, кроме усталости и-в лучшем случае-чувства исполнения долга. Главное достижение заключается в том, что неизвестно, откуда появляется новая ценность и удивительное качество энтузиазма, направленного на её достижение. Если человек заканчивает программу с чувством огромной радости, или гигантского облегчения, или даже с чувством отвращения к ней, всё это тоже неплохо, хотя и символизирует актуальный буддхиальный стресс и потенциальные событийные осложнения. Плохо, если уже фактически мёртвую программу никак не удаётся окончить и она всё крутится и крутится на Буддхиальном Теле, откровенно его отравляя. Иногда в таких случаях требуется духовная (молитва) или психиатрическая помощь.

Включение Тельца нарушает то, что называется логикой событий, которая, по мнению многих практиков, полностью регулирует событийный поток. Типичный пример тельцовского включения-поворот событий, обусловленный тем, что человек начинает вести себя в соответствии с некоторыми своими убеждениями, которые до того дремали,- например, в нём просыпается совесть или чувство долга или, наоборот, злая воля эгоистической системы ценностей. Таков же механизм пробуждения и включения национально-освободительных движений: сначала пробуждается дремлющая миссия этноса и через Овна меняет ему систему ценностей, акцентируя национальную идею (иногда с этой целью посылается крупный иноземный завоеватель), после чего она, будучи не в силах реализоваться на Буддхиальном Плане, полностью или в большей своей части засыхает на корню и поступает в канал Тельца, производя в народе шовинистическое брожение, смуту, экспансионистические тенденции, в лучшем случае - объединение против общего врага.

Первый уровень
На первом уровне проработки Тельца всякий поворот событий является для человека полной неожиданностью и застаёт его врасплох. "Ну кто бы мог подумать, что такое может случиться?!"- восклицает он в искреннем изумлении или по поводу внутреннего события: "Никогда и не подозревал, что я на такое способен!" Человек пока ещё не подозревает о наличии канала Тельца. С его точки зрения, событийный поток частично управляем только на горизонтальном уровне, то есть своими усилиями, а в остальном абсолютно хаотичен или подчинён непосредственно воле Божьей, для человека непостижимой.
Человек оказывается в полном рабстве у потока текущих событий и ему ни на что не хватает времени: за что бы он ни взялся, в самый неподходящий момент возникает некоторое "обстоятельство", требующее немедленного участия и отмены или отсрочки всех дел, которые этого не терпят. Совершенно необходимая для поддержания существования скучная рутина занимает почему-то всё его время целиком, и вырваться из неё и хоть что-то сделать он никак не успевает. Для этого уровня характерно большое количество полностью или почти полностью вытесненных в подсознание ценностей, которые влияют на поток событий человека незаметным, но очень существенным образом, делая его действительно маловразумительным и по видимости хаотичным как для самого человека, так и для большинства посторонних наблюдателей.
Обычно на первом уровне проработки Тельца у человека бывает пара несовместимых, иногда даже прямо отрицающих друг друга ценностей (одна из них вытеснена в подсознание), которые создают специфические событийные эффекты. Таких людей часто можно увидеть на приёме у психотерапевта, задача которого в первую очередь состоит в том, чтобы извлечь из подсознания клиента вытесненные ценности, препятствующие осуществлению его сознательных программ, после чего клиент уже должен сам решить, чего же он, собственно, хочет. Человек не верит в силу собственных душевных программ: они представляют для него абстракцию, не имеющую никакого отношения к реальным событиям. Такой человек совершенно теряет почву под ногами при включении Тельца, поскольку события при этом начинают развиваться для него непредсказуемым и неуправляемым образом, но когда событийный поток слабеет, то жизнь становится невыносимо скучной, этот человек также совершенно теряется.

Деньги. Денег или хронически нет, и никакие усилия не помогают, или они сами по себе неожиданно приходят и так же нерегулируемо исчезают, но толку никакого от них не бывает.
Этика для такого человека-понятие абстрактное и с непосредственной жизнью никак не связанное: в своих поступках он предпочитает ориентироваться на внутреннюю и внешнюю событийную ситуацию, а не на какие-то принципы: что плохо лежит, тихо присвоит, а под настроение может незнакомому человеку оказать значительную услугу.
Государство. Если в государстве плохо проработан Телец, то создать в нём демократическое общество граждан, добровольно подчиняющихся закону, чрезвычайно трудно, поскольку само по себе законопослушное поведение есть признание власти над собой конкретной физической жизнью буддхиального законодательства, то есть подчинение своих поступков тельцовским трансляциям.

Второй уровень
На втором уровне проработки Тельца человек пытается найти какие-то пути управления событийным потоком и, в частности, понять причины его резких поворотов, а также, в некоторых случаях, устойчивости. "Без труда не вытащишь и рыбки из пруда"- человек осознаёт, что, не приложив достаточного количества душевных усилий (буддхиальной энергии), существенно изменить характер или направление событийного потока невозможно,- если в один прекрасный или ужасный день он не изменится сам. Ему всё же остаётся непонятным, почему, даже приложив большое количество душевных сил и материальных затрат, к некоторым целям не удаётся даже слегка приблизиться, а другие проекты осуществляются легко и как будто сами собой.
Этот человек старается относиться к потоку событий и собственным действиям сознательно: он членит свою жизнь на события и старается соотнести их с программой достижения своих целей, например: это событие удаляет меня от такой-то цели и нейтрально по отношению к остальным, а этот поступок приближает к этакой-то. На этом уровне царствует иллюзия, что поток событий можно разделить на куски, соответствующие достижению поставленных себе целей.
Человек также понимает, что для выполнения серьёзной программы нужно обладать определёнными добродетелями и иметь устойчивое желание ею заниматься. Он искренне считает, что основные его препятствия - внешние или собственные недоработки: несдержанность, несобранность, плохая внутренняя дисциплина, недостаточная находчивость и т.д.
Буддхиально - ориентированный человек этого уровня перед включением Тельца ощущает некоторое душевное напряжение, означающее скорое появление нового поворота событий, но он не понимает, зачем это нужно, и не обращает на деятельность Тельца особого внимания, упуская очень важные возможности.
Каузально-ориентированный человек старается извлечь из тельцовских трансляций максимум для себя возможного, в результате чего зачастую насилует естественную работу Каузального Тела: энергично манипулирует событиями, не вникнув толком во внутренний баланс как самого Тела, так и организма в целом.

Третий уровень
На третьем уровне проработки Тельца происходят очень большие изменения в понимании человеком природы потока событий и его движущих сил.
Он начинает осознавать, что имеет на события своей жизни, куда большее влияние, чем ему это казалось раньше. На этом уровне осознаются многие ценности, прежде вытесненные глубоко в подсознание, и человек довольно отчётливо видит, что большинство из них плохо совместимы с другими, и это обстоятельство находит прямое отражение в цепочках событий, которые рвут друг друга как враждебные живые существа.
Человек начинает ощущать свои ценности как наделённые силой порождать цепочки событий - как его собственных действий и поступков, так и обстоятельств, приходящих извне. При этом оказывается, что в событиях так или иначе материализуется вся система ценностей-как тех, которых человек добивается (положительные) или активно избегает (отрицательные), так и имеющих характер глубоких убеждений (жизненные позиции), принципиально важных для его картины мира. Хотя жизненные позиции константны, то есть не требуют достижения, они играют активную роль в формировании потока событий, вызывая к жизни такие эпизоды, которые их подтверждают, и препятствуя возникновению ситуаций, их подрывающих.
Правильного видения причин возникновения тех или иных цепочек событий у этого человека ещё нет. Ему по-прежнему кажется, что в той части потока событий, над которой он властен, важнее его разум и воля (канал Козерога), нежели убеждения (канал Тельца). Интуитивно он чувствует и понимает, что для осуществления серьёзных каузальных программ требуется большая работа над собой. Обычно такой человек ограничивается выработкой в себе мирских добродетелей, таких, например, как честность, добросовестность, надёжность, вежливость, трудолюбие, умеренность вплоть до разумного аскетизма там, где это необходимо, но до корней своего ЭГОизма и атеизма не доходит, хотя вполне искренне считает себя верующим.
На этом уровне всё ещё нет ощущения единства Каузального потока, то есть отражения в каждом конкретном эпизоде всех ценностей человека: человек уже видит неоднозначность каждого события, то есть их различия в их ролях в разных жизненных программах, и старается действовать так, чтобы своими действиями приближаться к нескольким целям сразу.

Четвёртый уровень
На четвёртом уровне проработки Тельца человек понимает, что поток событий регулируется ценностями человека, которые так или иначе материализуются на основе, поставляемой его планами и конкретными жизненными обстоятельствами. Каждый человек как-то планирует свою конкретную жизнь, но её обстоятельства складываются так, чтобы материализовались все его ценности без исключения, осознаваемые и неосознанные: положительные, отрицательные и константные. Человек учится косвенно, но эффективно регулировать поток событий, вырабатывая новые жизненные позиции и меняя акценты ценностей в картине мира. При этом он видит, как много ошибок он совершал в прошлом: неуклюже вмешивался непосредственно в поток событий, игнорировал смену собственных ценностей и события, являющиеся прямым следствием этой смены.
Канал сам по себе эволюционирует и синтезирует гораздо более приемлемый для человека поток событий. При этом он требует от человека большей работы над Буддхиальным Телом, которое в целом должно стать более культурным: в его внутреннем мире и внешних программах должен быть налажен определённый культурный порядок, в частности, преодолены все явные противоречия. События внешней и внутренней жизни приходят в значительное согласование, и основные жизненные программы идут существенно успешнее, пропадают большие куски бессмысленных или малоэффективных усилий, не приносящих человеку ничего, кроме скуки и разочарования. Даже малоэнергетичные события его жизни часто нагружены большим ценностным (духовным) смыслом - это означает, что человек учится работать тонко и ему может быть поручена ответственная работа. На этом уровне человек хорошо ощущает многозначность каждого события своей жизни и его связь с программами достижения и поддержки ценностей. Если же и Овен достаточно проработан, то за событиями жизни человека начинают просвечивать не только ценности, но и Идеал: это означает, что человек вышел на духовный путь.

Сильный Телец
Сильный Телец чаще всего даёт мощную каузальную энергетику. Его ценности и жизненные позиции энергично стремятся воплотиться в конкретные события, но пока первые плохо осознаны и согласованы друг с другом, последние текут слишком бурным и неуправляемым потоком, чтобы им можно было спокойно наслаждаться.
Этот человек предназначен Природой для того, чтобы трудиться (эффективно формировать поток событий вокруг себя). Иногда этот труд виден всем, иногда только самому человеку, если события преимущественно внутренние (работа писателя), но бездельниками такие люди оказываются редко-слишком много у них энергии и практического энтузиазма, который, в отличие от Близнецов, они склонны претворять не в слова, а в дела.
С этим человеком интересно, поскольку события крутятся вокруг него, но если они окажутся вам не по вкусу, то лучше держитесь от него подальше или будьте с ним осторожны, поскольку, даже сильно отдавив вам ногу, Телец не станет сильно огорчаться и извиняться: для первого он слишком толстокож, а для второго-чересчур убеждён в правильности всего происходящего с ним и вокруг него. Человек в глубине души чувствует свою этическую правоту, даже если недопустимо грубо вторгается в чужую жизнь.
За этические нарушения сильный Телец наказывается не сразу, но тяжело, поскольку успевает заварить очень крупную событийную кашу, и потом долго и трудно её расхлёбывает(в случае гармоничного Тельца расхлёбыванием чаще всего занимаются окружающие, и это его не смущает).
Этому человеку нужно понять, что у других людей гораздо меньше сил, чем у него, и научиться их за это не презирать, а сочувствовать и помогать в реализации их программ. Главная задача сильного Тельца-тщательная работа над Буддхиальным Телом, в частности, забота о чистоте своих ценностей. Сильный Телец может оказаться по-детски наивным и доверчивым по отношению к человеку с достаточно сильной буддхиальной энергетикой, который сумеет имплантировать ему свои ценности, после чего Телец начинает их энергично добиваться. Когда вновь обретённые Тельцом ценности смешаются с прежними, в событийном потоке возникнет очень своеобразный синтез, то есть цепочка поступков и событий, которые могут вовсе не устроить его вдохновителя.
Вдохновясь новой ценностью, он энергично принимается за её достижение, но результат чаще всего оказывается совсем не таким, каким человек его себе представлял.

Гармоничный Телец
Гармоничный Телец обладает незаменимым свойством - уютно устраиваться в потоке событий, которые, кажется, сами по себе складываются наиболее выгодным для человека образом в отношении его ценностей.
Форменным бичом этого человека может оказаться вязкая лень, обволакивающая его каждый раз, когда уровень его усилий превосходит некоторую величину, или же сибаритство, препятствующее иногда совершенно необходимым в жизни элементам аскетизма. Иной раз ему даже захочется взять на себя чужую тяжёлую ношу, но обстоятельства обязательно складываются таким образом, что в последний момент эта ноша ложится на спину другу или соседу.
Этому человеку часто трудно поверить в серьёзность происходящего с ним, поскольку самые трагические повороты событий он воспринимает в сильно смягчённом виде, а сигналы внутренней тревоги и крупных внешних перемен часто не замечает или не придаёт им значения.
Этому человеку нужно понять, что другие люди живут не так, как он, и научиться ценить своё событийное счастье (в частности, финансовое) и распространять его на других людей.
На высоком уровне этот человек может стать крупным руководителем, учёным-организатором, психологом, адвокатом, дипломатом или философом этического направления, и всегда его деятельность будет отличаться редким даром гармонично сочетать на практике интересы самых разных людей и коллективов; но любить его будут за несравненно мягкое обаяние и умение дать любому пришедшему к нему человеку ровно ту помощь и улыбку, в которых тот нуждается.

Слабый Телец
Слабый Телец долго сохраняет иллюзию независимости своего событийного потока от своих взглядов, убеждений, ценностей и вообще картины мира. Эта иллюзия свойственна всем людям, но при слабом Тельце возникающие как бы ниоткуда цепочки событий обычно малозначительны и не очень тревожат человека. Человек не будет обеспокоен материализацией и достижения своих ценностей, и время от времени крупные сгустки событий будут неожиданно обрушиваться на него, подобно лавине; однако эти событийные бури обычно быстро проносятся мимо и в скорости забываются.
У него будет малоинтенсивным процесс трансформации ценностей в события. Важнейшие перемены в его жизни не переживаются им как сколько-нибудь крупные события. В целенаправленной деятельности слабого Тельца будет часто недоставать специфического вдохновения, свойственного людям, пылко добивающимся от жизни своих ценностей.

Поражённый Телец
Поражённый Телец получает от жизни значительно больше неприятностей, чем заслуживает по своему моральному облику. Сам человек, скорее всего, считает, что закон его существования,- хроническое невезение.
На низком или среднем уровне этот человек причиняет массу беспокойства и неприятностей своим близким и в первую очередь самому себе. В нём сидит нечто, не дающее довести до конца никакую программу и умеющий превратить во зло самые лучшие намерения: это баламут, возмутитель спокойствия, Ходжа Насреддин и Остап Бендер - великий комбинатор, чьи комбинации с удивительным постоянством начисто проваливаются.
У этого человека есть некоторый, очень непростой жизненный ритм, к которому он в конце концов частично приспосабливается и выучивается доводить до конца некоторые свои мероприятия. В основе обучения здесь лежит чрезвычайное внимание к малейшим знакам судьбы и внутреннему голосу, их комментирующему. С возрастом человек начинает понимать, что только строгое подчинение этому голосу, каких бы душевных затрат и жертв оно ни стоило, способно провести его через бушующий порог до тихого плеса, который вряд ли окажется длинным.
В результате человек учится смирению и очень точной душевной настройке, что даёт ему возможность исполнять трудоёмкие и требующие большой самоотверженности программы. Если же человек не смиряется, то ему предстоит судьба чёрного учителя, способного поломать жизнь многим людям, или просто озлобленного мучителя своих близких, когда-то талантливого, а теперь ставшего жертвой своих жизненных обстоятельств и болезней.
Если Карма в целом не сильно поражена, то у этого человека с детства вероятны периоды чрезвычайной активности, когда он с увлечением и не обращая внимания на усталость занимается различными делами, которые могут быстро сменяться периодами резкого нигилизма, неприятия всего мира и его окрестностей. К тем и другим состояниям лучше всего относиться с уважением, помогая ребёнку понять, что в основе любой успешной деятельности лежит соответствующая внутренняя готовность, которая в его случае вырабатывается долгими и тщательными усилиями.

© Подводный Авессалом. Каббалистическая астрология. М. АСТ-ПРЕСС, 2000. 784 с.

В ветеринарной клинике неврологии, травматологии и интенсивной терапии доктора Сотникова помимо других услуг осуществляется лечение рептилий. Эта область, к сожалению, не сильно развита в нашей стране, поэтому в нашем отделении герпетологии встречаются пациенты, диагноз которым не могли поставить многие ветеринарные врачи других клиник. Так, одним их самых проблемных заболеваний в лечении змей является болезнь телец включений.
Болезнь телец включений (IBD- Inclusion Body Disease) – это инфекционное заболевание, вызывающее системное нарушение клеточного метаболизма рептилий, индуцированное ретровирусом и имеющее характерные клинические манифестации (проявление первых симптомов, начало видимой части болезни).Данное заболевание у змей вызывает РНК-содержащий вирус из семейства Retroviridae. В основном данное заболевание поражает боид (питонов, удавов). Сомнительные случаи болезни телец включений были описаны у ужеобразных змей, маисовых полозов, пальмовых ботропсов.
IBD у змей характеризуется хроническим поражением клеток, не приводящим на раннем этапе к их разрушению, образованием крупных эозинофильных включений в цитоплазме различных клеток эпителия и нейронах центральной нервной системы.
Источником инфекции являются персистентные (длительные) носители и клинически больные животные. Распространение, вероятно, происходит: с помощью пассивной передачи змеиным клещом; контактно; через пищу и воду, а также путем вертикальной передачи – от родителей к потомству.
Клинически болезнь у змей проявляется истощением организма, слабостью, снижением активности физиологических процессов, затруднением или нарушением линьки, стоматитом, пневмонией, неврологическими расстройствами - неравенством величины зрачков, задиранием и подергиванием головы, искривленным положением колец тела, опистотонусом (судорожная поза «дуги»). Некоторые змеи с IBD имеют клинику лимфомы, лейкоцитарные реакции, кожные новообразования.
Патогномоничным симптомом, то есть однозначно описывающим болезнь, для удавов и питонов считают воспаление и формирование абсцессов (очаговых гнойных воспалений, которые характеризуются образованием полостей, заполненных гноем) в салитарных фолликулах пищевода, развитых у ложноногих змей.
Диагностика болезни телец включений в нашей стране может быть осуществлена при помощи гистологического исследования желез пищевода, полученного при эзофагоскопии с последующей биопсией, и обнаружение в цитоплазме клеток крупных эозинофильных включений. Включения изредка можно обнаружить в миелоцитах и лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. При лейкоцитарных реакциях включения выявляются в цитоплазме приблизительно в 1 % периферических лимфоцитов.